Родился в пос. Олымский Касторенского района Курской области (отец — литовец, мать — болгарка).
Среднее образование получил в г. Железноводске Ставропольского края.
Окончил Саратовское театральное училище и долгое время (с перерывом на действительную службу во флоте — старшина 2-й статьи) работал актёром в Саратовском ТЮЗе.
В 2001 г. в Москве окончил РАТИ (ГИТИС, курс П. Фоменко).
В театре «Мастерская Петра Фоменко» поставил две пьесы своего любимого драматурга А. Слаповского «Двадцать семь» (дипломный спектакль) и «От красной крыши до зелёных звёзд».
Ещё будучи студентом РАТИ, в каникулярное время собирал вокруг себя самарских актёров и ставил с ними разные пьесы. Так родился театр «Понедельник» — молодой и своеобычный самарский коллектив, кочующий по разным сценам.
С мая 2003 г. — главный режиссёр Магнитогорского театра драмы им. А.С. Пушкина.
В 2009-2011 гг. — главный режиссёр Ярославского драматического театра им. Волкова.
На кинофестивале «Кинотавр — 2007» С. Пускепалис получил приз «За лучшую мужскую роль» (вместе с Леонидом Броневым) за участие в фильме «Простые вещи».
На кинофестивале «Берлинале — 2010» получил приз «Серебряный медведь» за роль в фильме Алексея Попогребского «Как я провёл этим летом». С. Пускепалис и дебютант в кино Григорий Добрыгин признаны лучшими актёрами фестиваля.
В 2015 г. как кинорежиссёр снял фильм "Клинч".
В 2018 г. С. Пускепалис назначен заместителем художественного руководителя МХАТ имени М. Горького по творческой работе.
С августа 2019 г. — художественный руководитель Российского государственного академического театра драмы имени Ф.Г. Волкова в Ярославле.
Погиб в автокатастрофе. Похоронен в Железноводске рядом с родителями.
Награды: премия "Ника" (2007), премия "Белый слон" (2007), приз кинофестиваля "Кинотавр" (2007), приз "Меридианы Тихого" (2007), приз "Серебряный медведь" "Берлинале-2010" , премия "Золотой орёл" (2017), приз Российского кинофестиваля "Литература и кино" в Гатчине (2013), приз Ассоциации продюсеров кино и телевидения (2014).
6 февраля 2023 г. указом Президента России В. Путина награждён орденом Мужества.
Фильмография: "Прогулка»" (2003), "Простые вещи" (2006), "Скоро весна" (2008), "Как я провёл этим летом" (2009),, "Попытка Веры" (2010), "И не было лучше брата" (2011), "Жизнь и Судьба" (2012), "Метро" (2012), "Крик совы" (2013), "А у нас во дворе..." (2012-2014), "Крик совы" (2013), "Ледокол" (2016), "Большие деньги" (2016), "Частица Вселенной" (2017), "Алекс Лютый" (2019), "А у нас во дворе-2" (2019), "Шифр" (2019, 2020), "На острие" (2020), "Идеалист" (2021), "Бессмертные" (2021), "Мария. Спасти Москву" (2021), "1941. Крылья над Берлином" (2022), "Хронос" (2022) и др.
Всего сыграл в кино свыше 60 ролей.
Пьесы, поставленные С. Пускепалисом,
в театре «Мастерская Петра Фоменко»:
«Двадцать семь»,
«От красной крыши до зелёных звёзд»,
«Египетские ночи»;
в Магнитогорском театре драмы:
«Козий остров» (У. Бетти),
«Блин-2» (А. Слаповский),
«Такси. Скорость. Две жены...» (Р. Куни),
«Исполнитель желаний» (А. Курейчик);
в театре п/р О. Табакова:
«Женитьба Белугина» (А. Островский, Н. Соловьев).
14 апреля 2023 г. в г. Донецке, у здания драматического театра, открыли памятный знак Сергею Пускепалису. В честь актёра назвали театральный сквер.
15 апреля 2023 г. в Железноводске имя С. Пускепалиса присвоили городскому Дворцу культуры, в нём открылся музей посвящённый российскому актёру и режиссёру.
В г. Саратов на фасаде дома № 45 по улице Сакко и Ванцетти, где жил Сергей Пускепалис установили мемориальную доску.